Kết quả đề tài: Xuất sắc

Phân lập cDNA mã hóa yếu tố đông máu của người; Nghiên cứu biểu hiện trong tế bào động vật nuôi cấy và kiểm tra hoạt tính đông máu của sản phẩm protein tái tổ hợp

Năm bắt đầu thực hiện: 2009

Năm kết thúc thực hiện: 2010

Năm nghiệm thu: 19/05/2011

Hemophilia là bệnh rối loạn đông máu di truyền. Cho tới nay, những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng cDNA nhằm sản xuất các chế phẩm protein tái tổ hợp F8 và F9 trong tế bào động vật nuôi cấy (CHO) đã phát triển vượt bậc. Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có đề tài/công bố nào về nghiên cứu sản xuất yếu tố đông máu F8/F9 tái tổ hợp trong tế bào động vật được thực hiện. Đề tài được thực hiện nhằm một bước hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm protein tái tổ hợp F8 hoặc F9, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng trong tương lai. \Đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật hiện đại như: tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA, xử lý DNA bằng enzyme hạn chế, phản ứng nối ghép gen, biến nạp plasmid, tách chiết DNA plasmid,...Kết quả thu được như sau: \- Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, các nhà nghiên cứu đã tách được RNA tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp gen F8 và F9 cDNA. \- Khuếch đại và phân lập thành công các đoạn cDNA mã hóa cho các vùng chức năng của yếu tố đông máu F8 (A1, A2, B, A3, C1 và C2) và toàn bộ trình tự cDNA mã hóa F9. \- Khi so sánh trình tự F9 cDNA đầy đủ của 3 dòng plasmid p18, p19 và p22 với trình tự trên ngân hàng GenBank (NM_000133), chúng tôi thấy ở dòng p18 có sai khác ở 6 vị trí nucleotide dẫn đến sai khác ở 3 vị trí amino acid : c.56 T>C (p. L19P), c.608A>G (p.N203S), c.1100T>C, c.1296T>C, c.1314A>G và c.1376A>T (p. K459M); ở p22 có sai khác ở 3 nucleotide dẫn đến sai khác ở 1 vị trí amino acid: c.413T>C, c.1078T>C (p.F360L) và c.1341A>G và dòng p19 có độ tương đồng là 100% ở cả mức độ nucleotide và amino acid. Ba trình tự cDNA mã hóa F9 được đăng ký vào Ngân hàng gen quốc tế GenBank với các mã số FR846238, FR846239 và FR846240; \- Thiết kế và biểu hiện thành công vector tái tổ hợp pcDNA3/F9-1 mang gen mã hóa yếu tố đông máu F9 trong tế bào động vật CHO; \- Tinh sạch và thử được hoạt tính protein tái tổ hợp F9; \- Tối ưu hóa được phương pháp nuôi cấy ổn định các dòng tế bào động vật CHO. \Nhóm nghiên cứu đề nghị được phát triển các nghiên cứu hoàn thiện tiếp theo, tiếp tục nghiên cứu biểu hiện F9.

Phân lập được các đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu số F9 và/ hoặc yếu tố đông máu số F8 từ mô người; Thiết kế được các vector mang các đoạn cDNA nói trên và nghiên cứu biểu hiện chúng trong tế bào động vật nuôi cấy (CHO); Nghiên cứu tinh sạch các sản phẩm polypetide tái tổ hợp, tạo được F8 hoặc/và F9 tái tổ hợp có hoạt tính

Công nghệ sinh học